Para subtrair colunas no Excel, utilize a seguinte fórmula:
=coluna1 - coluna2
Por exemplo, se você deseja subtrair a coluna B da coluna A, utilize:
=A1 - B1
Basta ajustar as referências de células de acordo com a sua planilha. Certifique-se de que as colunas têm o mesmo número de linhas, caso contrário, o Excel retornará um erro.